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Praktische Tipps und Tricks für eine erfolgreiche Transfektion mit nicht-viralen, chemischen Transfektionsmethoden
Nicht-virale Transfektionsmethoden können in physikalische und chemische Transfektionsmethoden unterteilt werden. Die chemischen Transfektionsmethoden beruhen auf der elektrostatischen Bindung der Nukleinsäuren mit den Carrierkonstrukten zu sogenannten Lipoplexen oder Polyplexen, je nachdem, ob sie sich von positiv geladenen Liposomen/Lipiden oder Polymeren ableiten.
Alle chemischen Transfektionsmethoden haben ähnliche Schwächen und Stärken, da sie einem ähnlichen Mechanismus folgen. Kennt man diese, kann man Fehler bei der Transfektion vermeiden und zu besseren Ergebnissen kommen.
Folgende Punkte sind für eine erfolgreiche Transfektion mit Lipoplexen oder Polyplexen von Bedeutung:
Reinheit der Nukleinsäuren
Zellgesundheit
Proliferation der Zellen bei Plasmidtransfektion
Optimierungsparameter Nukleinsäure : Reagenz-Verhältnis & Lipoplex-/Polyplexmenge
Optimaler Messzeitpunkt
Aufbau eines erfolgreichen Transfektionsexperimentes
Adhäsion an Plastikoberflächen und Alterung von Lipoplexen
Up & Downscale
Stabile Transfektion
Angeborenes Immunsytem
Freeze/Thaw Prozedur
Randeffekte
Mikroskop-FACS-GFP
Sonderfall Suspensionszellen
Vergleiche von Versuchen
Reinheit der Nukleinsäuren
Vom Grundsatz her sollte auf eine hohe Qualität der eingesetzten Nukleinsäuren geachtet werden. Werden synthetisch erzeugte Konstrukte bei der Transfektion eingesetzt, wie das häufig z.B. bei siRNA der Fall ist, reicht die von den meisten Herstellern angebotene Qualität in der Regel aus. Werden allerdings zellfreie biologische Systeme, Zellkulturen oder Bakterien zur Synthese der Konstrukte eingesetzt, muss diesem Thema mehr Aufmerksamkeit gewidmet werden. Zum einen sollte auf Verunreinigungen mit nicht zielführenden Nukleinsäuren geachtet werden, die das erwünschte Ergebnis verringern oder durch „Off-Target“ Effekte stören können. Insbesondere sollten aber Verunreinigungen im Focus der Aufmerksamkeit stehen, die vom angeborenen Immunsystem der Zellen detektiert werden können, wie es z.B. bei Plasmiden der Fall ist, die in E. coli Stämmen produziert werden. Werden solche Plasmide beim Aufreinigungsprozess nicht von Lipopolysacchariden bzw. Endotoxinen befreit, kann es zu stark erniedrigten Transfektionseffizienzen kommen. Das angeborene Immunsystem vieler Zelltypen ist in der Lage, solche Endotoxine über den Toll-like-Rezeptor 4 (TLR 4) zu detektieren. Als Reaktion wird ein Abwehrstatus eingenommen, der eine Transfektion erschwert.
Bei der Aufreinigung der Plasmide mit der „Miniprep“-Methode werden Endotoxine nicht ausreichend entfernt. Bei Verwendung von Aufreinigungskits ist darauf zu achten, dass sie die Qualitätsanforderung „endotoxin free“ erfüllen.
Zellgesundheit
Für eine erfolgreiche Transfektion müssen die Zellen gesund sein. Während eine bakterielle Kontaminationen schnell zum Verlust der Kulturen führen kann, werden Verunreinigungen mit Pilzen oder insbesondere Mykoplasmen häufig nicht erkannt und bleiben in der lebenden Zellkultur latent vorhanden.
Gerade die Anwendung von Antibiotikagemischen wie Penicillin/Streptomycin zur Vermeidung bakterieller Kontaminationen fördert allerdings die Möglichkeit einer Kontamination von Mikroorganismen, die von diesen Antibiotika nicht abgetötet werden, wie z.B. Pilze und Mykoplasmen.
Das hat folgenden Grund:
Nach unserer Erfahrung sind die Zellkulturprodukte, die früher als Einfallstor für Mykoplasmen oder andere Verunreinigungen verdächtigt wurden, nämlich Serum und Trypsin, inzwischen sicher, wenn man Sie von Qualitätsherstellern bezieht.
Als Hauptquelle für Kontaminationen bleibt der Mensch und Kreuzkontaminationen
übrig. Da eine selektive Kontamination mit Mykoplasmen oder Pilzen ausgeschlossen ist, ist der beste Schutz, Zellkultur ohne Antibiotika zu betreiben. Für erfahrenes Personal ist das kein Problem. Sollte es dennoch zu einer Kontamination kommen, wird dies sofort zum sichtbaren bakteriellem Wachstum führen und damit allerdings auch zum Verlust der Kultur. Da die meisten Kulturen jedoch leicht ersetzbar sind, ist das kein großes Problem.
Wird ohne Antibiotika gearbeitet, ist das Risiko einer Kreuzkontamination damit auch gesenkt.
Durch verschiedene weitere Maßnahmen lässt sich das Risiko einer Kreuzkontamination weiter reduzieren. Beispielsweise kann die Lagerung der gefrorenen Zellen in der Gasphase über dem flüssigen Stickstoff in den Kryogefäßen und nicht im flüssigen Stickstoff selbst erfolgen. Eine räumliche und zeitliche Trennung der Zellkulturarbeiten verschiedener Kulturen senkt das Risiko weiter ab.
Trotzdem sollte auf ein Monitoring der Zellen, insbesondere bezüglich Mykoplasmen nicht verzichtet werden. Unserer Auffassung nach sind Färbemethoden hier nicht zuverlässig genug. Detektionskits basierend auf PCR (z.B. MycoSPY® oder MycoSPY® Master Mix) sind zwar etwas aufwändiger, aber dafür extrem zuverlässig.
Mykoplasmen
Mykoplasmen stellen in der zellbiologischen Forschung ein ernstes Problem dar. Sie sind extrem weitverbreitet und werden häufig nicht detektiert. Mykoplasmen sind Bakterien, die durch die üblichen Antibiotika wie Penicillin und/oder Streptomycin nicht abgetötet werden und mikroskopisch nicht sichtbar sind. Von den Zellen werden Mykoplasmen über das angeborene Immunsystem detektiert. Die Folge ist, dass die Zellen einen Abwehrstatus einnehmen, der eine Transfektion erschwert. Die Zellen proliferieren auch langsamer als gewöhnlich, was ein weiteres Hemmnis für eine erfolgreiche Transfektion darstellt. Insgesamt können Mykoplasmen dazu führen, dass die Transfizierbarkeit von Zellen um bis zu 95% abnimmt.
Von der generellen Anwendung von gegen Mykoplasmen gerichteten Antibiotika zur Prophylaxe raten wir ab. Es würde die Bildung resistenter Mykoplasmen-Stämme fördern. Geht man vom Personal als Hauptquelle einer Kontamination mit Bakterien und Mykoplasmen aus, so würden die Antibiotika zunächst alle Mikroorganismen zerstören. Käme es zur Ausbildung von Resistenzen bei Bakterien, würden diese die Zellkultur relativ schnell überwuchern und damit die Kontamination aufzeigen. Nicht so bei der Bildung von resistenten Mykoplasmen, die die Zellkultur nicht überwuchern würde. Für die Behandlung von mit Mykoplasmen kontaminierter Zellkulkturen bietn wir MycoRAZOR® an.
Proliferation der Zellen bei Plasmidtransfektion
Während die Transfektion von RNA von der Zellteilung und damit vom Wachstum unabhängig ist, da der Wirkort der RNA das Zytosol ist, muss eine proteinkodierende DNA in den Zellkern gelangen, um seine Wirkung zu entfalten. Da es bis heute nicht gelungen ist einen aktiven Transportprozess für Plasmide in den Zellkern zu etablieren, sind die Plasmide im Wesentlichen auf die Zellteilung angewiesen, um in den Zellkern zu gelangen. Dieses Phänomen wir auch als „Nuclear Barrier“ bezeichnet. Entsprechend schwierig sind sich wenig oder gar nicht teilende Zellen zu transfizieren (z.B. Neuronen). Teilt sich die Zelle nicht, ist der Zutritt der Plasmide in den Zellkern weitgehend versperrt. Weitgehend deshalb, da es Hinweise gibt, dass Plasmide mit entsprechend passenden Sequenzen über einen Huckepack Mechanismus („piggy-back“) von Transkriptionsfaktoren in den Zellkern mitgeschleppt werden können.
Um optimale Ergebnisse in Hinblick auf eine Proteinausbeute zu erzielen, z.B. für die Produktion von Viren, Antikörpern oder anderer Proteine, ist es daher notwendig zum Zeitpunkt der Lipoplexgabe für die größtmögliche Proliferation der Zellkultur zu sorgen.
Weiß man um diesen Zusammenhang zwischen Proliferation und dem Erfolg bei der Transfektion mit Plasmiden, kann man mit verschiedenen Maßnahmen die Erfolgswahrscheinlichkeit bzw. die Transfektionseffizienz erhöhen.
Medium & Serum
Zunächst ist darauf zu achten, dass die Wahl des Mediums die richtige ist. Häufig werden in der Literatur Medien für einen Zelltyp vorgeschlagen, die keineswegs das optimale Wachstumsverhalten fördern. Gelegentlich können alternative Medien (oft mit einem höheren Glukosegehalt) gefunden werden, die eine bessere Proliferation erzielen. Auch die Qualität des Serums kann eine Auswirkung auf die Proliferationsgeschwindigkeit haben. Auch hier sollte sichergestellt werden, dass das Serum qualitativ den Anforderungen entspricht.
Anzahl der ausgesäten Zellen
Idealisiert folgen Zellen der gleichen „idealen“ Wachstumskurve. Diese teilt sich in eine lag-Phase mit schwachem Wachstum (auch Anlaufphase oder Latenzphase genannt) und eine log-Phase, also einer Phase mit logarithmischem Wachstum. Wie oben erklärt, ist es vorteilhaft den Lipoplex oder Polyplex zu Beginn der log-Phase zuzugeben.
Entgegen weitverbreiteter Meinung beginnt die Log-Phase für die meisten Zelltypen, wenn die Wachstumsfläche annähernd bedeckt ist. Das hängt damit zusammen, dass der Begriff "Konfluenz", definiert als das Einstellen des Wachstums einer adhärenten Zellkultur durch Kontakt-Inhibition, zu der Annahme führt, dass Zellen, die gegenseitig Kontakt haben, das Wachstum einstellen. Die realen Verhältnisse sind aber andere, da eine optisch dichte adhärente Zellkultur das Wachstum nicht einstellt, wie aus den folgenden Bildern ersichtlich wird.
Es muss daher das Ziel sein, so viele Zellen auszusäen, dass zum Zeitpunkt der Lipoplexgabe/Polyplexgabe die Log-Phase gerade erreicht ist. Auf diese Weise erhält man die größte Rate an transfizierten Zellen und die höchste Proteinausbeute. Da bis zur maximalen Expression der Proteine allerdings ca. 48 Stunden vergehen, erhält man eine relativ dicht gewachsene Zellkultur.
Leider weichen auch viele Zellen von diesem Wachstumsverhalten ab. Manche proliferieren schneller, mache langsamer und manche zeigen einen anderen Verlauf der Wachstumskurve. Obwohl es einige Arbeit ist, eine Wachstumskurve für die eigenen Zellen zu erstellen, kann es sich auszahlen, wenn man optimale Transfektionsergebnisse erhalten möchte.
Zielt man auf eine maximale Transfektionseffizienz ab, und sät eine entsprechend hohe Zellzahl aus, so kann es insbesondere bei schnell proliferierenden adhärenten Zellen passieren, dass die Kultur in den „überkonfluenten“ Bereich kommt, in dem sich ein Teil der Zellen abkugelt und in Apoptose geht. Natürlich werden die Zellen auch durch eine Transfektion mit hohen Nukleinsäuremengen, wie sie für eine maximale Transfektioneffizienz notwendig sind gestresst. Damit übereinstimmend scheinen sich transfizierte Zellen eher abzukugeln als untransfizierte. Transfiziert man mit Plasmiden, die für GFP (Grün fluoreszierendes Protein) codieren, kann man diese Zellen häufig im Zellüberstand mikroskopisch erkennen. In der Regel sind diese Zellen überwiegend nicht mehr vital, können aber zur Protein oder Virenausbeute beitragen. Werden die Kulturen vor der Ernte oder dem Assay gespült, erhält man entsprechend nur Teilergebnisse.
In Hinblick auf mikroskopische oder verschiedene andere zellbiologische Untersuchungen ist es häufig nicht erwünscht eine dichte gestresste Kultur nach der Transfektion zu erhalten, d.h. man möchte zum Zeitpunkt der Messung der Transfektion eine relativ lockere Bewachsung der Wachstumsoberfläche mit möglichst vitalen Zellen. Man kann dies erreichen, indem man am Anfang der Transfektion die Zellen mit einer entsprechend geringeren Zellzahl aussät und die Nukleinsäuremenge und das Nukleinsäuremenge-Reagenz-Verhältnis daraufhin optimiert. Aufgrund der geringeren Proliferation ist jedoch damit zu rechnen, dass die Transfektionsraten deutlich niedriger sind. Alternativ kann natürlich auch eine dichte transfizierte Kultur durch subkultivieren sozusagen „verdünnt“ werden.
Hat man es mit Zellen zu tun, die sich von Haus aus nur langsam oder überhaupt nicht teilen, ist es möglicherweise ratsam, eine Transfektion mit mRNA in Betracht zu ziehen. Im Handel werden in-vitro-Transkriptionsysteme angeboten, mit denen entsprechende RNA hergestellt werden kann.
Optimierungsparameter Nukleinsäure:Reagenz-Verhältnis & Lipoplex-/Polyplexmenge
Die Menge an Lipoplexen/Polyplexen muss der Anzahl der ausgesäten Zellen angepasst werden. Dabei hängt es vom Zelltyp ab, wie viel Nukleinsäure toleriert wird. Eine zu hohe Lipoplex-/Polyplexmenge führt zu toxischen oder apoptotischen Effekten. Eine zu niedrige Menge führt zu niedrigeren Transfektionseffizienzen. In der Tat ist es in der Regel die in der Zelle freigesetzte Nukleinsäure, die eine negative Auswirkung auf die Vitalität der Zellen zeigt und weniger das Transfektionsreagenz.
Man kann Lipoplexe/Polyplexe mit unterschiedlichen Mengen von Nukleinsäuren und Transfektionsreagenz herstellen. Entscheidend dabei ist, dass der entstehende Komplex eine positive Nettoladung tragen muss, damit er transfektionsaktiv ist. Allerdings zeigen auch positiv geladene Komplexe mit unterschiedlichem Nukleinsäure:Reagenz-Verhältnis bei verschiedenen Zellen zum Teil sehr unterschiedliche Transfektionsergebnisse. Daher sollte für jeden Zelltyp mit dem jeweiligen Reagenz eine Optimierung durchgeführt werden. In der Regel geben die Hersteller sinnvolle Optimierungsparameter an.
Idealerweise findet die Optimierung des Nukleinsäure:Reagenz-Verhältnisses und die optimale Lipoplex-/Polyplexmenge bzw. die optimale Nukleinsäuremenge für die vorher festgelegte Zellzahl gleichzeitig statt, da diese Parameter nicht vollkommen unabhängig voneinander sind. In den Manuals der Hersteller finden sich häufig Angaben zu Mengenbereichen für die Nukleinsäure bezogen auf verschiedene Zellkulturgefäße. Des Weiteren sind i.d.R. Bereiche für Nukleinsäure:Reagenz-Verhältnisse angegeben. Die angegebenen Bereiche sind als empirische ermittelte Parameter zu verstehen, innerhalb derer optimale Resultate wahrscheinlich sind. Dabei ist wichtig in Erinnerung zu behalten, dass die Bereiche für die Nukleinsäuremengen sich auf Zelldichten beziehen, die die maximale Transfektionseffizienz ermöglichen. Will man also mit geringeren Zelldichten arbeiten müssen diese Bereiche angepasst werden.
Es ist zu vermuten, dass man über das Nukleinsäure:Reagenz-Verhältnis die Stabilität des Lipoplexes einstellt. Je mehr Reagenz (Lipid/Polymer) verwendet wird, desto stabiler ist der Lipoplex. Man muss sich darüber im Klaren sein, dass die Lipoplexe bzw. die Nukleinsäuren von den Zellen z.B. durch Nukleasen, die sich im Zytosol befinden abgebaut werden und daher eine begrenzte Lebensdauer haben.
Es gibt verschiedene Szenarien, auf die sich die Stabilität der Lipoplexe unterschiedlich auswirkt:
Ist der Wirkort der Nukleinsäure das Zytosol (siRNA/mRNA), so profitieren die Ergebnisse von einer schnell erreichten hohen Konzentration der Nukleinsäure im Zytosol. Dementsprechend sollte der Lipoplex zwar positiv geladen sein, um Endozytose zu ermöglichen, aber ansonsten eher weniger stabil sein, um eine schnelle Freisetzung der Nukleinsäure ins Zytosol zu ermöglichen.
Ist der Wirkort der Nukleinsäure (Plasmide) der Zellkern, können die Verhältnisse andere sein. Zellen, die sich langsam teilen, profitieren z.B. davon, wenn der Lipoplex stabiler ist, damit bei späteren Zellteilungen auch noch Lipoplex bzw. freie Nukleinsäure vorhanden ist.
Merke: Da die Proliferationsgeschwindigkeit bei einer Kultur auch davon abhängt, wie viele Zellen vor der Transfektion ausgesät wurden, kann sich die optimale Nukleinsäuremenge und das Nukleinsäure:Reagenz-Verhältnis verändern, wenn man die Anzahl der ausgesäten Zellen ändert!!
Optimaler Messzeitpunkt
Je nach Zelltyp, Reporter oder Experiment kann die Zeitspanne nach der Transfektion bis zur Messung für ein optimales Ergebnis unterschiedlich sein. Die Reporter GFP (Grün fluoreszierendes Protein) und Luciferase haben zwar etwas unterschiedliche Halbwertszeiten, aber der optimale Zeitpunkt, also die maximale Proteinexpression, liegt hier in der Regel trotzdem bei etwa 36 bis 48 Stunden nach einer Plasmid-Transfektion. Wird mRNA verwendet ist dieser Zeitraum wesentlich kürzer (ca. 16-24 Stunden). Geeignete Zeitspannen für Knockdown-Nachweise mittels siRNA hängen davon ab, ob sie auf mRNA (RT-qPCR) oder Proteinebene stattfinden. Wenn sie auf Proteinebene stattfinden, geht die Halbwertszeit des Proteins maßgeblich mit ein.
Aufbau eines erfolgreichen Transfektionsexperimentes
Ein erfolgreiches Transfektionsexperiment wird daher folgendermaßen aufgebaut:
- Sicherstellen der Qualität der Nukleinsäure
- Sicherstellen der Zellgesundheit
- Bei Plasmidtransfektion: Proliferation der Zellen optimieren
- Anzahl der auszusähenden Zellen (je nach Ziel des Experimentes) festlegen
- Nukleinsäuremenge und Nukleinsäure:Reagenz-Verhältnis bezogen auf die Zellzahl optimieren
- Zum optimalen Messzeitpunkt das Experiment auswerten
Adhäsion an Plastikoberflächen und Alterung von Lipoplexen
Grundsätzlich neigen geladene Moleküle, wie Nukleinsäuren und kationische Lipide oder Polymere an Glas- und Plastikoberflächen zu adhäsieren. Während bei hochkonzentrierten Lösungen der dadurch eintretende Massenverlust vernachlässigbar ist, liegen die Verhältnisse bei verdünnten Lösungen, wie sie zur Lipoplexbildung verwendet werden anders. Nach unserer Erfahrung lässt sich dieser Effekt nicht vermeiden. Unter den zur Verfügung stehenden Materialien für ein Gefäß zur Lipoplexbildung schneidet Polypropylen noch am besten ab (vor Polystyrol und Glas). Es ist daher darauf zu achten, die Standzeiten der verdünnten Lösungen so kurz wie möglich zu halten. Auch Lipoplexe neigen dazu an Plastikoberflächen zu adhäsieren. Lipoplexe neigen zusätzlich dazu zu „altern“. Das heißt es kommt zur Aggregation der Lipopolexe zu größeren Einheiten, die von den Zellen durch Endozytose nicht mehr aufgenommen werden können. Damit sinkt ihre Transfektionsfähigkeit. Somit sollte nach der Lipoplexbildung so zügig wie möglich mit den Arbeiten fortgefahren werden.
Up & Downscale
Aufgrund der Adhäsion von Lipoplexen an freie Plastikoberflächen, können Transfektionsexperimente nicht einfach über die Proportionalität der Wachstumsflächen auf anders dimensionierte Kulturgefäße übertragen werden. In einem 96-Well ist die freie Plastikoberfläche der zylindrischen Seitenwände im Verhältnis zur bewachsenen Wachstumsfläche wesentlich größer als in einem 6-Well. Das bedeutet, dass wesentlich mehr Lipoplex in einem 96-Well an den Seitenwänden verloren geht, als in einem 6-Well. Die meisten Hersteller von Transfektionsreagenzien empfehlen daher im Manual angegebene Mengen für das Up & Downscale. Da die Ladung der Lipoplexe und damit ihr Adhäsionsverhalten von der Zusammensetzung abhängt, können diese Angaben nur eine grobe Näherung sein. Die beste Strategie ist es, das Transfektionsexperiment bei einem Formatwechsel neu zu optimieren.
Stabile Transfektion
Will man Zellen stabil transfizieren, so muss man die wenigen Zellen mit einem Selektionsantibiotikum selektieren, die die Plasmid-DNA zufällig in ihr Genom integriert haben. Dazu ist es notwendig, dass das Plasmid die entsprechende Resistenz gegen das Antibiotikum trägt. Man kann die Wahrscheinlichkeit der zufälligen Integration erhöhen, indem man das Plasmid linearisiert. Bei der Selektion hat sich die Strategie bewährt, den Selektionsdruck langsam zu erhöhen.
Angeborenes Immunsytem
Das angeborene Immunsystem spielt bei Transfektionsprozessen eine wichtige Rolle. Zellen können grundsätzlich über endosomale Rezeptoren (z.B. Toll-like-Rezeptoren) aber auch durch zytosolische Rezeptoren alle gängigen Nukleinsäuren detektieren und zwischen „fremd“ und „eigen“ unterscheiden. Wird eine fremde Nukleinsäure detektiert, kommt es durch Signaltransduktionskaskaden zur Umstellung der Proteinexpression in der Zelle, um eine Abwehrhaltung aufzubauen. Weiter werden Botenstoffe, insbesondere Interferon-ß ausgeschüttet, so dass auch Zellen, die nicht im direkten Kontakt mit der Nukleinsäure waren, eine Abwehrhaltung aufbauen.
Die Ausprägung des angeborenen Immunsystems ist jedoch von Zelltyp zu Zelltyp unterschiedlich. Neben der Proliferationsfähigkeit dürfte darin die unterschiedliche Transfizierbarkeit unterschiedlicher Zellsorten im Wesentlichen begründet sein.
Besonders Suspensionszellen und primäre Zellen sind im Vergleich zu adhärenten Zelllinien schwieriger zu transfizieren.
Da sich Suspensionszellen von Immunzellen ableiten, soweit nicht adhärente Zellen an Suspensionbedingungen adaptiert wurden, verfügen diese Zellen logischerweise über ein ausgeprägtes Immunsystem.
Primäre Zellen sind durch entsprechenden Selektionsdruck ebenfalls mit einem besseren angeborenen Immunsystem ausgestattet als Zelllinien, die diesem Selektionsdruck in der Zellkultur nicht mehr ausgesetzt sind. Ein gutes Beispiel sind HEK293 Zellen, in denen wir keinerlei Nukleinsäure-detektierende Rezeptoren nachweisen konnten – sie gelten als leicht zu transfizierende Zellen. Die Entwicklung des K2® Transfection System und später des K4® Transfection System trägt der Rolle des angeborenen Immunsystems bei der Transfektion mit synthetischen Carriersystemen Rechnung.
Freeze/Thaw Prozedur
Werden Liposomenlösungen über lange Zeit bei 4°C oder bei RT gelagert, kann es zu einer Koagulation der Liposomen kommen. Auf diese Weise verschiebt sich die Liposomengrößenverteilung zu größeren Liposomen hin, was eine schlechtere Transfektionseffizienz nach sich ziehen kann. Wie im Manual der METAFECTENE Serie (METAFECTENE®, METAFECTENE® PRO, METAFECTENE® SI) und des K2® Transfection Reagent/K4® Transfection Reagent beschrieben, kann für diese Reagenzien die ursprüngliche Liposomengrößenverteilung durch einen Freeze-Thaw-Zyklus wieder hergestellt werden. Dazu wird das Reagenz über Nacht bei -20° eingefroren, am nächsten Tag aufgetaut und bei 4°C gelagert. Der Freeze-Thaw-Zyklus schadet den enthaltenen Molekülen nicht und kann beliebig oft durchgeführt werden. Wir empfehlen die Durchführung vor der ersten Anwendung und danach alle 4 Wochen.
Randeffekte
Bei Multiwellplatten beobachtet man häufig bei exakt gleichen Bedingungen am Rand schlechtere Transfektionsergebnisse als in der Mitte der Platten. Das liegt daran, dass die äußeren Wells mehr von Verdunstungseffekten betroffen sind, als die Inneren Wells. Dadurch konzentrieren sich die Salze im Medium auf und die Osmolalität ändert sich. Die Zellen leiden und proliferieren nicht mehr so gut. Als Konsequenz sinkt die Transfektionseffizienz. Durch regelmäßiges Prüfen des Wasserstandes (für die Luftfeuchte) im Inkubator kann in der Regel Abhilfe geschaffen werden. Zudem sollte im Zweifelsfall eher mit mehr als mit weniger Medium gearbeitet werden.
Mikroskop-FACS-GFP
Einer der am häufigsten benutzten Reporter ist das „Grün fluoreszierende Protein“ oder kurz GFP. Transfiziert man eine Zelle mit einem entsprechenden Plasmid, das für GFP codiert, so wird im Zytosol der Zelle GFP produziert. Dadurch lassen sich transfizierte Zellen mittels eines Fluoreszenzmikroskops oder eines FACS identifizieren.
Die Ergebnisse dieser Analysen hängen jedoch von verschiedenen Faktoren ab.
wtGFP, eGFP und TurboGFP
Das „wild type“ GFP wird heute praktisch nicht mehr verwendet, da mit dem „enhanced“ GFP ein deutlich stärker emittierendes GFP zur Verfügung steht. Das ursprüngliche GFP stammte aus einer Qualle (Aequorea victoria). Durch den Austausch weniger Aminosäuren im Chromophor ist es gelungen, dessen Emmission deutlich zu steigern. Dieses eGFP hatte so großen Erfolg, dass es das „wild type“ GFP praktisch vollständig verdrängte. Inzwischen gibt es allerdings viele eGFPs, deren Protein teilweise auch von anderen Organismen, z.B. von einem Flußkrebs (Pontellina plumata) stammt, und die unterschiedliche Emmissionsvermögen zeigen. Die Varianten aus der Flußkrebsfamilie (Copepod) werden häufig auch als copGFP oder TurboGFP bezeichnet, häufig sind sie jedoch lediglich als eGFP deklariert. Aufgrund ihrer hohen Leuchtkraft empfehlen wir diese Variante, da sie die sensitivste Möglichkeit darstellen, mit GFP Transfektion nachzuweisen.
Aufgrund dieser unterschiedlichen Sensitivitäten unterscheiden sich auch die gemessenen Transfektionsraten in Abhängigkeit von der GFP-Variante deutlich. Auch im Hinblick auf unterschiedliche Promoter ist ein Vergleich verschiedener Resultate mit Vorsicht zu genießen.
Das gilt im weiteren Sinne auch für die Messmethode. Während ein FACS hochsensitiv jede Zelle erfasst, deren Fluoreszenz über der der Eigenfluoreszenz liegt, ist bei mikroskopischem Auszählen, die Empfindlichkeit des Photochips oder des menschlichen Augen maßgebend. Entsprechend wird man die höchste Transfektionseffizienz mit FACS bestimmen, die niedrigste bei der Auszählung mit dem Mikroskop ohne digitale Unterstützung.
Es ist also möglich, dass scheinbar sehr unterschiedliche Resultate in Wirklichkeit relativ ähnlich sind. Umgekehrt kann es sein , dass scheinbar vergleichbare Ergebnisse, die mit dem gleichen Plasmid erzeugt wurden, in Wirklichkeit sehr unterschiedlich sind, nämlich wenn mit dem Mikroskop und einer Kamera gearbeitet wurde, deren Belichtungszeit mittels Software auf „automatic“ oder „auto exposure“ gestellt wurde. Hier können relativ unterschiedliche Ergebnisse nivelliert werden, da schwach emittierende Kulturen mit hoher Belichtungszeit und stark emittierende Kulturen mit niedriger Belichtungszeit fotografiert werden.
Sonderfall Suspensionszellen
Adherente Zellen sind in eine extrazelluläre Matrix eingebettet, die sie selbst erzeugen. Diese wird ständig durch Exo- und Endozytose auf- und abgebaut. Es wird vermutet, dass die meisten Lipoplexe/Polyplexe an negativ geladene Bestandteile dieser extrazellulären Matrix binden und auf diese Weise durch Endozytose internalisiert werden.
Klassische Suspensionszellen, also nicht solche die an Suspensionsbedingungen adaptiert wurden, haben praktisch keine extrazelluläre Matrix. Da sie sich von Immunzellen ableiten besitzen sie ein stark ausgeprägtes angeborenes Immunsystem. Dementsprechend findet die Aufnahme der Lipoplexe/Polyplexe lediglich durch Phagozytose statt und ist entsprechend gering und zudem begleitet von einem hohen Abwehrstatus der Zellen. Es ist daher kein Wunder, dass Suspensionszellen generell als schwierig zu transfizierende Zellen gelten.
Die Endozytoseaktivität kann mit fluoreszenzgelabelten Transfektionreagenzien und einem FACS vermessen werden.
Medienzusätze wie Transferrin und Insulin, die bei der Lipoplex/Polyplexherstellung zugegen sind und in den Lipoplex/Polyplex eingebaut werden, können die Aufnahmenrate der Komplexe durch rezeptorvermittelte Endozytose erhöhen, da jede Zelle, auch Suspensionszellen, Rezeptoren für diese Moleküle besitzt.
Vergleiche von Versuchen
Unterschiedliche Versuchsergebnisse mit exakt gleichen Versuchsparametern sind keine Seltenheit. Ergebnisse von Transfektionsexperimenten weisen eine erhebliche Schwankungsbreite auf.
Das liegt im Wesentlichen daran, dass der physiologische Status der Zellen nie gleich ist. Werden die Zellen trypsiniert und zur Vorbereitung eines Transfektionsexperimentes ausgesät, so befinden sie sich in einem bestimmten Stresslevel, der bei einem anderen Erntevorgang anders sein kann.
Des Weiteren sind Zellzahlbestimmungen mit einem hohen Fehler behaftet, was dazu führt, das das Erreichen der Log-phase sich um entscheidende Stunden verschieben kann, was einen fundamentalen Einfluss auf die Transfektionsergebnisse haben kann, wenn man mit Plasmiden arbeitet.
Generell gilt, dass Versuchsergebnisse vergleichbar sind, wenn die Experimente mit der gleichen Zellsuspension gemacht wurden, die idealerweise auf das gleiche Kulturgefäß ausgesät wurde (z.B. 6-Well Plate).
