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Zellkultur frei von Mykoplasmen

FAQ Mycoplasmenfreie Zellkultur
 

Reagenzien für mykoplasmenfreies Arbeiten

Die Kontamination von Zellkulturen mit Mycoplasmen ist eines der Hauptprobleme in der zellbiologischen Forschung, da sie die Physiologie der Zelle beeinflussen bzw. ändern. Wegen ihrer parasitären Eigenschaften und der guten Anpassung an die Wirtszellen finden sich Mykoplasmen häufig als Kontamination in Zellkulturen.[1]

Mykoplasmen besitzen keine Zellwand. Aus diesem Grund sind sie gegenüber Antibiotika, wie sie häufig in der Zellkultur angewendet werden (z.B. Pen/Strep) unempfindlich, da diese auf die bakterielle Zellwandsynthese abzielen. Das Fehlen einer Zellwand in Kombination mit ihrer geringen Größe (typischerweise 0,2 – 0,3 μm) erschwert aber auch ihren Nachweis mit konventionellen Mikroskopen. Ihre geringe Größe und ihre sehr flexible Form bedingt zudem, dass Mycoplasmen nicht durch Sterilfiltration aus flüssigen Medien entfernt werden können.

Mykoplasmen bleiben auch wegen des Fehlens von makroskopischen Effekten oftmals sehr lange Zeit unentdeckt. Gerade beim routinemäßigen Arbeiten mit Standard-Antibiotika fällt ein Befall der Zellkultur mit Mycoplasmen, insbesondere durch das Laborpersonal lange Zeit nicht auf, da die Kontamination mit anderen Bakterien durch die zugesetzten Antibiotika selektiv verhindert wird, während die gleichzeitig mit eingeschleppten Mykoplasmen sich ungehindert vermehren können.

Es erscheint vor diesem Hintergrund kaum verwunderlich, dass verschiedene Studien eine Kontamination von bis 40% der Zellkulturen mit Mycoplasmen ergeben haben. Als mögliche Ursachen für diese hohe Zahl an Kontaminationen gelten die Einschleppung durch das Laborpersonal, Medien, Seren, Trypsin, Kreuzkontaminationen bereit infizierter Zellkulturen oder die Gewinnung von Zellkulturen aus bereits infizierten Organismen.[3]

 

Literatur:
1. H.G. Drexler, C. Uphoff; Cytotechnology 39(2), 75 – 90 (2002) [PubMed ID: 19003295]
2. Photo: M. Rohde, GBF, Braunschweig; C. Uphoff, DSMZ, Braunschweig
3. T. Lindl, J. Bauer: „Zell- und Gewebekultur“; Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1987); R.J. Hay, M.L. Macy, T.R. Chen; Nature 339, 487 (1989) [PubMed ID: 2725683]

 

Da das Vorhandensein einer Kontamination die Ergebnisse, die aus Zellkulturen gewonnen werden, verfälschen bzw. im schlimmsten Fall das Wachstum der Zellen so stark beeinträchtigen kann, dass es zum Totalverlust der Kultur kommt, müssen Zellkulturen routinemäßig auf Mykoplasmenbefall untersucht werden. Speziell im Falle der Transfektion von Zellen muss eine Kontamination mit Mycoplasmen auf jeden Fall ausgeschlossen werden, da durch ihren negativen Einfluss auf das Wachstum und die Stoffwechselaktivität der Zellen die Transfektionseffizienzen drastisch absinken.

 

Kleine Ursache – große Wirkung: Mykoplasmen

Bei Mycoplasmen handelt es sich um eine von mehreren Arten parasitisch oder kommensalisch mit Menschen, Tieren und Pflanzen lebenden Bakterien aus der Klasse der Mollicutes. Die über 100 bis heute bekannten Arten der Gattung Mycoplasma beschränken sich per Definition auf Wirbeltiere als Wirte, wo sie als Erreger für zahlreiche Krankheiten (z.B. Lungenentzündung durch Mycoplasma pneumoniae) bekannt sind.

Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Mykoplasmen-Kolonie auf einer Zelloberfläche

Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Mykoplasmen-Kolonie auf einer Zelloberfläche [2]

Mykoplasmen zeichnen sich besonders durch ihre geringe Größe und das Fehlen einer Zellwand aus. Deswegen sind auch Antibiotika, die die Zellwände angreifen, bei Mykoplasmen wirkungslos. Das Genom ist mit 0,58 – 1,38 Megabasenpaaren bei einem niedrigem GC-Gehalt (18 – 40 mol%) das kleinste aller zur Autoreplikation befähigten Prokaryonten.

Mycoplasmen sind als Aerobier bis fakultative Anaerobier ideal an ihre Wirte angepasst und finden gerade deshalb unter Zellkulturbedingungen (37°C) optimale Wachstumsbedingungen vor.

 

Mycoplasmen ...

...beeinträchtigen das Zellwachstum
...verringern die Stoffwechselaktivität der Wirtszellen
...modulieren die zelluläre Cytokinproduktion
...induzieren chromosomale Aberrationen in vitro
...passieren Standard-Sterilfilter
...sind unempfindlich gegenüber üblicherweise in der Zellkultur eingesetzten Antibiotika wie Penicillin oder Streptomycin
...sind resistent gegenüber hohen Temperaturen und Austrocknung
...beeinträchtigen die Transfizierbarkeit von Zellen

Kontamination mit Mykoplasmen:

In nahezu allen bekannten Zelltypen können sich Mycoplasmen parasitär vermehren, was eine ubiquitäre Verbreitung zur Folge hat. Hauptkontaminationsquellen sind Laborpersonal, aber auch Trypsin und FBS, beides über tierische Quellen erzeugte Zellkulturadditive. Die meisten Anbieter dieser Medien können lediglich für Mykoplasmenfreiheit unterhalb der Detektionsgrenze garantieren, was jedoch ein unzureichendes Kriterium darstellt. Schon eine einzige Zelle sorgt für die Durchseuchung eines kompletten Zellkulturansatzes. Die Abbildung zeigt den Effekt einer Mycoplasmen-Kontamination auf das Wachstum von HeLa Zellen.

 

Effekt einer Mykoplasmenkontamination auf das Wachstum von HeLa Zellen

Einflussnahme der Mycoplasmen auf die Transfektionseffizienz:

Das Besondere an einer Mykoplasmen-Kontamination ist, dass sie optisch nicht sichtbar ist und nicht zum Zelltod führt, weshalb sie über einen sehr langen Zeitraum unentdeckt bleiben kann. Trotzdem beeinträchtigen diese Bakterien in ganz erheblichem Maße den Transfektionserfolg:

    • • Aufgrund des hohen Bedarfs der Mycoplasmen an Arginin wird das Zellwachstum erheblich eingeschränkt
    • • Mykoplasmen modulieren die Zytokin-Produktion der Zelle
    • • Mykoplasmen verursachen chromosomale Abberationen
    • • Mykoplasmen halten sich in der Zellmembran auf, wodurch Zellmembranvorgänge, wie Endozytose, moduliert werden können.

Alle hier beschriebenen Einflüsse der Kontamination auf die physiologischen Prozesse der Zelle sind auch wesentlich am Transfektionsprozess beteiligt. Eine erhebliche Beeinträchtigung der Transfektion ist somit nicht verwunderlich und zeigt sich in der Graphik anhand von HeLa und HepG2 Zellen. Mit den kontaminierten Zellen konnten jeweils nur 17 und 5.6 % der normalen Transfektionseffizienz erreicht werden.

Einflussnahme von Mykoplasmen auf die Transfektionseffizienz | Biontex

Es wurden Hela- und HepG2-Zellen mit pCMVßgal auf 48 Well-Platten transfiziert. Die spezifischen Absorptionswerte wurden mittels ONPG- und BCA-Assay ermittelt.

 

 

Gängige Nachweismethoden zur Mykoplasmendetektion

DAPI-Färbung

Eine sehr häufig eingesetzte Methode zum Nachweis von Mykoplasmen ist die Färbung mit DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol). DAPI interkaliert in die kleine Furche der DNA und zeigt dort unter UV-Anregung eine blaue Fluoreszenz mit einem Maximum bei 460 nm. In unbefallenen Zellkulturen sind lediglich die Zellkerne angefärbt, während in kontaminierten Kulturen die DNA der an der Zelloberfläche befindlichen Mykoplasmen ebenso gefärbt wird. Aufgrund der geringen Größe können einzelne Mycoplasmenzellen nicht aufgelöst werden, erst bei einer sehr großen Zahl äußert sich ihr Vorhandensein durch einen oft nicht eindeutig identifizierbaren Schleier um die Zellkerne.

PCR

Eine demgegenüber weitaus empfindlichere und verlässlichere Nachweismethode stellt die Polymerasekettenreaktion (PCR) dar, mit deren Hilfe eine Kontamination durch Mykoplasmen bereits in einem sehr frühen Stadium und bei sehr niedriger Konzentration detektiert werden kann. Dieses Verfahren lässt sich im Zelllabor routinemäßig einsetzen.

Sonstige

Oft werden ELISA-Tests für den routinemäßigen Nachweis von Mycoplasmen eingesetzt. Diese Methode ist dem DAPI-Test jedoch bezüglich ihrer Sensitivität und Spezifität keineswegs überlegen. Weiterhin wäre die Elektronenmikroskopie zu nennen, die jedoch einen sehr viel höheren apparativen und zeitlichen Aufwand erfordert.
 
Fazit
Zum Nachweis von Mykoplasmen bieten wir daher eine Reihe PCR-basierter Mycoplasmen Test-Kits an:

MycoSPY® (konventioneller PCR Test-Kit)
MycoSPY® Master Mix (PCR Test-Kit als Master Mix mit integriertem Loading Buffer und Tracking-Farbstoffen für die Gelelektrophorese)

Diese Produkte können sowohl bei etablierten Zelllinien als auch bei Primärzellen eingesetzt werden.

 

Vergleich MycoSPY® und DAPI-Färbung zur Erkennung von Mykoplasmen

DAPI staining of Cos7 and HepG2 cells

Mit DAPI gefärbte Cos7-Zellen ohne
Kontamination durch Mykoplasmen. Nur die
Zellkerne sind gefärbt.


Der Befall dieser HepG2-Zellen mit
Mykoplasmen ist in der DAPI-Färbung
nicht zu erkennen.

Contamination of H441-Luc cells with mycoplasma and detection using MycoSPY

Diese mit DAPI gefärbten H441-Luc-Zellen
zeigen erst bei einer extrem starken
Kontamination durch Mycoplasmen eine
schwach erkennbare
Färbung an der Zellperipherie.


Ein eindeutiger Nachweis wird bei
allen drei Zelllinien erst mit
MycoSPY® erbracht. Die Bande
bei 500 bp zeigt zweifelsfrei die
Mykoplasmenkontamination an.
Die interne Kontrolle bei 700 bp ist bei
der massiven Kontamination (Spur 3)
nicht mehr zu detektieren.


Methode DAPI-Test ELISA MycoSPY® Electron microscopy
Aufwand + + + −−
Kosten ++ 0 + −−
Empfindlichkeit −− ++ +
Gesamt + 0 ++++ −−−

 

 

Behandlung von mit Mycoplasmen kontaminierten Zellkulturen

 

Zur Behandlung von Zellkulturen, die mit Bakterien kontaminiert sind bieten sich Antibiotika an. Antibiotika, die an der Zellwand ansetzen (z.B. Penicilline) sind jedoch gegenüber Mycoplasmen praktisch unwirksam.

Mit dem Produkt MycoRAZOR® bieten wir daher ein Antibiotikagemisch an, dessen Wirkung auf der Inhibierung der Proteinbiosynthese (Transkription und Translation) beruht.