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FAQ Proteofektion

Hintergrundinformation Proteofektion
 

Frequently Asked Questions

► Was ist der Unterschied zwischen Proteofectene® und Proteofectene®AB?

PROTEOfectene® und PROTEOfectene® AB sind lipid-basierte Formulierungen, wobei PROTEOfectene® AB speziell für die Proteofektion von Antikörpern entwickelt wurde.

► Welche Qualität muss das verwendete Protein oder der Antikörper für eine Proteofektion haben?

Jegliche Verunreinigungen, Kontaminationen und Additive, die sich in der Proteinlösung befinden, können die Transporteffizienz von PROTEOfectene® oder PROTEOfectene® AB beeinträchtigen. Verwenden Sie folglich ein möglichst reines Protein/Antikörper. Stabilisatoren, wie z.B. Detergenzien, können den Proteintransport hemmen, wenn sie in großem Überschuss gegenüber dem Protein vorhanden sind. Stabilisatoren wie Glycerol oder ähnliche Additive stören den Transport hingegen nicht.

► Stört BSA in der Antikörperlösung eine Proteofektion mit Proteofectene AB?

BSA in der Antikörperlösung verhindert den Antikörper–Transport! Übliche Konzentrationen von BSA in Antikörperlösungen betragen 0.1 – 2% – das bedeutet 1 bis 20 mg/ml. BSA liegt in diesen Lösungen in großem Überschuss vor, konkurriert mit dem einzubringenden Antikörper bei der Bildung des Proteoplexes (Antikörper–PROTEOfectene® AB–Komplex) und verhindert so den Eintrag des Antikörpers.

► Stören Konservierungsmittel die Proteofektion?

Konservierungsmittel, wie z.B. Natriumazid, können zu Zytotoxizität führen, wenn sie in hohen Konzentrationen vorliegen. Falls nötig, können solche Konservierungsmittel per Dialyse entfernt werden.

► Was ist Proteofectene® und wie ist seine Wirkungsweise?

PROTEOfectene® ist eine lipid-basierte Formulierung, die einfach mit dem entsprechenden Protein gemischt wird und nicht-kovalent gebundene Komplexe mit Proteinen bildet. Diese Komplexe werden dann von den Zellen per Endozytose aufgenommen und die in Struktur und Funktion gänzlich unveränderten Proteine werden im Zytoplasma freigesetzt.
Inkubieren sie ihr Protein mit PROTEOfectene® in 1xPBS für 10-15 min. Nachdem der Komplex mit serumfreiem Medium verdünnt wurde, wird die Mischung direkt zu den Zellen gegeben. Nach 3-48 h kann der Versuch ausgewertet werden.

► Die Proteofektion meiner Zellen mit Proteofectene® und der Positivkontrolle R–Phycoerythrin ist erfolgreich, aber die Proteofektion mit meinem Protein funktioniert nicht!

Einige Proteine können aufgrund ihrer spezifischen Eigenschaften nicht effizient mit PROTEOfectene® transportiert werden. So sind zum Beispiel stark basische Proteine, die unter physiologischen Bedingungen positiv geladen sind, sehr schwer in Zellen einzubringen. Ein anderer Grund können Verunreinigungen des Proteins sein (z.B. Detergentien, Stabilisatoren, Konservierungsmittel).

► Warum reine Proteine direkt transfizieren?

Protein Transfektion (Proteofektion) ist extrem schnell verglichen mit der Transfektion von DNA. Durch Proteofektion werden Prozesse wie Transkription und Translation umgangen und damit eine potentiell schädliche, zufällige DNA Integration in das Genom der Zielzelle.
Durch das Einbringen eines aktiven Proteins mittels PROTEOfectene® direkt in die Zelle werden Studien für alle möglichen Fragestellungen, die Zellvorgänge betreffen, ermöglicht.

► Warum ist R–Phycoerythrin im Kit von Proteofectene® enthalten?

Das mitgelieferte R–Phycoerythrin (100 µg/ml) dient als Positivkontrolle. Es wird mit einem Protein:Lipid–Verhältnis von 1:2 (pro 1 µg Protein 2 µl PROTEOfectene®) verwendet.

R–Phycoerythrin konnte bereits in viele verschiedene Zellarten erfolgreich eingebracht werden. R-Phycoerythrin ist beim Erstellen neuer Versuche hilfreich und sollte bei jeder neuen Zelllinie zum Einsatz kommen. Außerdem kann bei auftretender Zytotoxizität mit Hilfe der Positivkontrolle entschieden werden, ob das Versuchsprotein einen Einfluss auf die Zellvitalität hat.

► Warum ist FITC–IgG im Kit von Proteofectene®AB enthalten?

FITC–IgG ist ein fluoreszenzmarkierter Antikörper (Immunoglobulin) und dient als Positivkontrolle. Es wird mit einem Antikörper:Reagenz–Verhältnis von 1:1 – 1:2 (pro 1 μg Antikörper 1–2 μl PROTEOfectene® AB) verwendet.

FITC–IgG ist beim Erstellen neuer Versuche hilfreich und sollte bei jeder neuen Zelllinie zum Einsatz kommen.

FITC–IgG konnte bereits in viele verschiedene Zellarten erfolgreich eingebracht werden. Die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Eintrag ist folglich hoch.