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FAQ Zellkultur frei von Mykoplasmen

Hintergrundinformationen Mycoplasmenfreie Zellkultur

 

Frequently Asked Questions

► Was ist der Unterschied zwischen dem MycoSPY® und dem MycoSPY® Master Mix Kit?

Bezüglich der Leistungsfähigkeit der Kits gibt es keinen Unterschied. Der MycoSPY® Kit ist ein klassischer PCR Kit mit einzelnen Komponenten (Taq-Polymerase, PCR Buffer mit dNTPs, Primer Mix), die vor der PCR gemischt werden müssen. Es sind weder Ladepuffer noch Trackingfarbstoffe für die Gelelektrophorese im Kit enthalten. Der MycoSPY® Master Mix Kit ist einfacher zu handhaben und zu verschicken. Der lyophilisierte Mastermix enthält alle für die PCR notwendigen Komponenten für die PCR und die Gelelektrophorese vorgemischt. Nach der Rekonstitution mit Wasser (im Kit enthalten) ist der Arbeitsablauf sehr einfach (siehe MycoSPY® Master Mix). Der Mastermix Kit ist stabiler und kann daher bei Raumtemperatur verschickt werden.

► Muss man nach jeder Standard-Anwendung von MycoRAZOR® (3 Passagen) einen Test auf Kontamination mit Mycoplasmen machen?

Ja. Eine Kontrolle auf vollständige Entfernung der Mykoplasmen durch MycoRAZOR® (z.B. mit MycoSPY® oder MycoSPY® Master Mix) ist wichtig, um dem Aufbau von Resistenzen vorzubeugen.
Eine vollständige Entfernung der Mycoplasmen ist entscheidend, da wie bei jeder Antibiotika-Anwendung der Fall einer Resistenzbildung auftreten kann.

► Nach einem Anwendungszyklus (3 Passagen) mit MycoRAZOR® war der Test auf Mykoplasmen erneut positiv. Was muss ich tun?

Überprüfen Sie zunächst, ob zwischen der letzten Anwendung von MycoRAZOR® und dem Nachweis von Mycoplasmen zwei Passagen ohne MycoRAZOR®-Anwendung durchgeführt wurden. Wenn das nicht der Fall war, könnten vor allem durch sehr sensitive Methoden wie PCR noch tote Mykoplasmen nachgewiesen worden sein.
Wurde der Mindestabstand zwischen letzter Anwendung und Test eingehalten, wenden Sie MycoRAZOR® in den nächsten fünf Passagen Ihrer Zellen an. Erhöhen Sie dabei die Dosis an MycoRAZOR® schrittweise, wie im Manual angegeben, bis maximal zur Verdünnung 1/25. Beachten Sie, dass (abhängig vom Zelltyp) eine Erhöhung der MycoRAZOR®-Konzentration immer die Gefahr von toxischen Effekten mit sich bringt. Sollten Sie also toxische Effekte (Verringerung der Proliferation; Veränderung der Zellmorphologie) bei Ihren Zellen beobachten, wenden Sie die zuletzt verwendete Dosis für die verbleibenden Zyklen an.
Überprüfen Sie unbedingt den Erfolg der Behandlung durch Verwendung eines Mycoplasmen Test Kits (z.B. MycoSPY® Master Mix Master Mix oder MycoSPY® Kit!)

► Nach überprüfter, erfolgreicher Anwendung von MycoRAZOR® ist erneut Mycoplasmen-Befall aufgetreten. Woher kann diese Kontamination stammen?

Eine Hauptkontaminationsquelle sind tierische, in der Zellkultur eingesetzte Produkte. Setzen Sie daher nur fötales Kälberserum (FBS) und Trypsin ein, das garantiert frei von Mykoplasmen ist.
Da Mycoplasmen zur Klasse der Mollicutes gehören und damit keine Zellwand aufweisen, sind sie gegen viele Antibiotika, die sich gegen die Synthese der Zellwand richten, resistent. Daher ist bei standardmäßigem Einsatz eines solchen Antibiotikums (z.B. Penicillin/Streptomycin) in der Zellkultur der Anwender selbst eine Kontaminationsquelle. Unsteriles Arbeiten wird in diesem Fall nicht bemerkt, da das zugesetzte Antibiotikum das Wachstum der meisten Bakterien – und damit makroskopische Anzeichen – verhindert, sich Mykoplasmen jedoch vermehren können.
Daneben ist auch die Kreuzkontamination von einer anderen Zellkultur möglich. Testen Sie daher stets alle in Kultur befindlichen Zellen und tauschen Sie möglicherweise kontaminiertes Zellkulturmaterial (Medium, FBS, Trypsin, Puffer) aus.

► Enthält MycoRAZOR® Doxy- oder Tetracyclin-verwandte Antibiotika?

Nein. MycoRAZOR® enthält keinerlei mit Doxy- oder Tetracyclin verwandten Antibiotika.

► Viele kommerzielle PCR-Tests auf Mykoplasmen enthalten eine Positivkontrolle und eine interne Kontrolle. Was ist der Unterschied?

Die meisten Kits zur PCR Detektion von Mycoplasmen enthalten als Positivkontrolle ein Plasmid, das für die 16S rRNA von Mykoplasmen codiert. Damit wird die Funktionalität der Primer sichergestellt. Dieses Plasmid erzeugt ein gleich oder ähnlich großes DNA Amplifikat, wie es zu erwarten wäre, wenn eine Mycoplasmenkontamination vorliegen würde. Daher muss die Positivkontrolle in einem separaten Ansatz durchgeführt werden. Zusätzlich ist in der Regel auch eine interne Kontrolle enthalten, die sicherstellen soll, dass die PCR nicht durch Proteine und Zelldebris aus dem Zellkulturüberstand inhibiert wird. Die interne Kontrolle erzeugt ein beliebiges Amplifikat, das sich in der Größe von dem Amplifikat einer mit Mykoplasmen kontaminierten Zellprobe unterscheidet. Die interne Kontrolle kann daher in jedem Ansatz mitgeführt werden.

► Warum enthält der MycoSPY® Kit und der MycoSPY® Master Mix Kit keine Positivkontrolle?

Der MycoSPY® Master Mix Kit sowie der MycoSPY® Kit enthalten als interne Kontrolle ein Plasmid, das für eine verkürzte Form der 16S rRNA von Mycoplasmen codiert. Die interne Kontrolle dient somit gleichzeitig als Positivkontrolle, stellt für jeden PCR Ansatz sicher, dass keine Inhibitoren durch den Zellkulturüberstand vorhanden sind und schließt damit falsch-negative Ergebnisse aus.

► Wie hoch ist die Sensitivität des MycoSPY® Kits und des MycoSPY® Master Mix Kits?

Der MycoSPY® Master Mix Kit sowie der MycoSPY® Kit detektieren mindestens 80 Kopien eines Mykoplasmengenoms. Wird die interne Kontrolle mitgeführt, ist die Empfindlichkeit etwas geringer. Da sich Mycoplasmen nach der Kontamination einer Zellkultur relativ schnell vermehren, ist diese Empfindlichkeit bei weitem ausreichend. Wir empfehlen daher, die interne Kontrolle bei jedem Ansatz mitzuführen, um etwaig vorhandene Inhibitoren (Proteine, Zelldebris), die aus der Zellkultur stammen, auszuschließen.

► Die Zellen, die mit dem MycoSPY® Kit oder dem MycoSPY® Master Mix Kit auf Mykoplasmen untersucht werden sollen wurden mit Antibiotika kultiviert. Sollte man besser antibiotika-freie Medien vor dem Nachweis verwenden?

Es ist nicht nötig, übliche Antibiotika wie Penicillin, Streptomycin oder Gentamycin zu vermeiden, da diese den Assay des MycoSPY® Master Mix Kit oder des MycoSPY® Kit nicht inhibieren.

► Kann man Zellkulturüberstände, die mit dem MycoSPY® Kit oder dem MycoSPY® Master Mix Kit untersucht werden sollen, lagern?

Ja. Wir empfehlen die Lagerung bei -20°C ohne Zusätze (z.B. DMSO). Nach dem Auftauen sollte der Zellkulturüberstand, wie im Manual beschrieben, behandelt werden.

► Wie lange sollte man nach dem Auftauen von Zellen warten, bis der Nachweis von Mycoplasmen mit dem MycoSPY® Kit oder dem MycoSPY® Master Mix Kit durchgeführt werden kann?

Wir empfehlen, die Zellen mindestens 48-72 Stunden zu kultivieren, bzw. bis eine Bedeckung der Wachstumsfläche von mindestens 80% erreicht ist. Bei Suspensionszellen sollte die Zelldichte in etwa der zur Subkultivierung empfohlenen Zellzahl entsprechen. Da die Mykoplasmen im Zellkulturüberstand nachgewiesen werden, sollte das Medium zwischenzeitlich nicht gewechselt werden.

► Wie häufig sollt man auf Mycoplasmen testen?

Wir empfehlen einen Test auf Mykoplasmen (z.B. mit dem MycoSPY® Master Mix Kit Kit oder dem MycoSPY® Kit) mindestens alle 1-2 Monate durchzuführen, insbesondere, wenn die Zellen mit Antibiotika (z.B. Pen/Strep) kultiviert werden. Diese Antibiotika verhindern die Entdeckung unsteriler Arbeitstechniken, die die Kontamination von Zellkulturen mit Mykoplasmen ermöglichen.