FAQ Zellkultur frei von Mykoplasmen

Ja. Eine Kontrolle auf vollständige Entfernung der Mykoplasmen durch MycoRAZOR® (z.B. mit MycoSPY® oder MycoSPY® Master Mix) ist wichtig, um dem Aufbau von Resistenzen vorzubeugen.
Eine vollständige Entfernung der Mykoplasmen ist entscheidend, da wie bei jeder Antibiotika-Anwendung der Fall einer Resistenzbildung auftreten kann.

Eine Hauptkontaminationsquelle sind tierische, in der Zellkultur eingesetzte Produkte. Setzen Sie daher nur fötales Kälberserum (FBS) und Trypsin ein, das garantiert frei von Mykoplasmen ist.
Da Mykoplasmen zur Klasse der Mollicutes gehören und damit keine Zellwand aufweisen, sind sie gegen viele Antibiotika, die sich gegen die Synthese der Zellwand richten, resistent. Daher ist bei standardmäßigem Einsatz eines solchen Antibiotikums (z.B. Penicillin/Streptomycin) in der Zellkultur der Anwender selbst eine Kontaminationsquelle. Unsteriles Arbeiten wird in diesem Fall nicht bemerkt, da das zugesetzte Antibiotikum das Wachstum der meisten Bakterien – und damit makroskopische Anzeichen – verhindert, sich Mykoplasmen jedoch vermehren können.
Daneben ist auch die Kreuzkontamination von einer anderen Zellkultur möglich. Testen Sie daher stets alle in Kultur befindlichen Zellen und tauschen Sie möglicherweise kontaminiertes Zellkulturmaterial (Medium, FBS, Trypsin, Puffer) aus.

Nein. MycoRAZOR® enthält keinerlei mit Doxy- oder Tetracyclin verwandten Antibiotika.

Bezüglich der Leistungsfähigkeit der Kits gibt es keinen Unterschied. Der MycoSPY® Kit ist ein klassischer PCR Kit mit einzelnen Komponenten (Taq-Polymerase, PCR Buffer mit dNTPs, Primer Mix), die vor der PCR gemischt werden müssen. Es sind weder Ladepuffer noch Trackingfarbstoffe für die Gelelektrophorese im Kit enthalten. Der MycoSPY® Master Mix Kit ist einfacher zu handhaben und zu verschicken. Der lyophilisierte Mastermix enthält alle für die PCR notwendigen Komponenten für die PCR und die Gelelektrophorese vorgemischt. Nach der Rekonstitution mit Wasser (im Kit enthalten) ist der Arbeitsablauf sehr einfach (siehe MycoSPY® Master Mix). Der Mastermix Kit ist stabiler und kann daher bei Raumtemperatur verschickt werden.

Die meisten Kits zur PCR Detektion von Mykoplasmen enthalten als Positivkontrolle ein Plasmid, das ein einkloniertes Amplifikat des entsprechenden Kits codiert. Damit wird die Funktionalität der Primer sichergestellt. Dieses Plasmid erzeugt ein gleich oder ähnlich großes DNA Amplifikat, wie es zu erwarten wäre, wenn eine Mykoplasmenkontamination vorliegen würde. Daher muss die Positivkontrolle in einem separaten Ansatz durchgeführt werden. Zusätzlich ist in der Regel auch eine Interne Kontrolle enthalten, die sicherstellen soll, dass die PCR nicht durch Proteine und Zelldebris aus dem Zellkulturüberstand inhibiert wird. Die Interne Kontrolle erzeugt ein beliebiges Amplifikat, das sich in der Größe von dem Amplifikat einer mit Mykoplasmen kontaminierten Zellprobe unterscheidet. Die interne Kontrolle kann daher in jedem Ansatz mitgeführt werden.

Um die Funktionalität unseres Kits zu gewährleisten, haben wir eine Interne Kontrolle entwickelt, die einer Positivkontrolle sehr ähnlich ist. Diese Interne Kontrolle besteht aus einem Plasmid mit einem Teil des Mykoplasmengenomes (16S rRNA Konsensussequenz) mit flankierenden Primerbindungsstellen. Diese Bindungstellen passen auch zu den Primern, die zur Detektion des Mykoplasmengenomes verwendet werden. Allerdings erzeugt die Interne Kontrolle ein in der Länge abweichendes Amplifikat. Ein Amplifikat gleicher Länge, wie sie eine echte Positivkontrolle erzeugen würde, könnte zur Folge haben, dass Kreuzkontaminationen falsch positive Ergebnisse vortäuschen. Eine echte Positivkontrolle brächte also keinen echten Mehrwert. Wir haben uns daher entschieden, keine solche Kontrolle anzubieten.

Die in kommerziell erhältlichen Kits enthaltenen Positivkontrollen sind in der Regel PCR-Amplifikate der entsprechenden Kits, die in Plasmide einkloniert wurden. Sie decken daher nicht das gesamte Mykoplasmengenom ab und passen dementsprechend nur zum jeweiligen Kit.

Die Anwesenheit der Internen Kontrolle senkt die Sensitivität der PCR leicht ab. Der Grund für die Absenkung der Sensitivität liegt darin, dass die Interne Kontrolle die gleichen Primer verbraucht, wie das Mykoplasmengenom. Normalerweise stellt dies kein Problem dar, da sich Mykoplasmen sehr schnell vermehren, so dass eine kontaminierte Zellkultur in kurzer Zeit eine hohe Konzentration an Mykoplasmengenom erreicht. Allerdings besteht der Nachteil, dass eine Kontamination im Frühstadium mit sehr geringer Mykoplasmenkonzentration nicht erkannt wird. Will man die volle Sensitivität erhalten, empfehlen wir die Probe in zwei einzelnen Tubes zu testen, einmal mit und einmal ohne Interner Kontrolle.

Der MycoSPY® Master Mix Kit sowie der MycoSPY® Kit detektieren mindestens 100 Kopien eines Mykoplasmengenoms unter optimalen Bedingungen (hochreine DNA, keine Interne Kontrolle). Wird die interne Kontrolle mitgeführt, ist die Empfindlichkeit etwas geringer. Da sich Mykoplasmen nach der Kontamination einer Zellkultur relativ schnell vermehren, ist diese Empfindlichkeit bei weitem ausreichend. Wir empfehlen daher, die Interne Kontrolle bei jedem Ansatz mitzuführen, um etwaig vorhandene Inhibitoren (Proteine, Zelldebris), die aus der Zellkultur stammen, auszuschließen.

Es ist nicht nötig, übliche Antibiotika wie Penicillin, Streptomycin oder Gentamycin zu vermeiden, da diese den Assay des MycoSPY® Master Mix Kit oder des MycoSPY® Kit nicht inhibieren.

Ja. Wir empfehlen die Lagerung bei -20°C ohne Zusätze (z.B. DMSO). Nach dem Auftauen sollte der Zellkulturüberstand, wie im Manual beschrieben, behandelt werden.

Wir empfehlen, die Zellen mindestens 48-72 Stunden zu kultivieren, bzw. bis eine Bedeckung der Wachstumsfläche von mindestens 80% erreicht ist. Bei Suspensionszellen sollte die Zelldichte in etwa der zur Subkultivierung empfohlenen Zellzahl entsprechen. Da die Mykoplasmen im Zellkulturüberstand nachgewiesen werden, sollte das Medium zwischenzeitlich nicht gewechselt werden.

Wir empfehlen einen Test auf Mykoplasmen (z.B. mit dem MycoSPY® Master Mix Kit Kit oder dem MycoSPY® Kit) mindestens alle 1-2 Monate durchzuführen, insbesondere, wenn die Zellen mit Antibiotika (z.B. Pen/Strep) kultiviert werden. Diese Antibiotika verhindern die Entdeckung unsteriler Arbeitstechniken, die die Kontamination von Zellkulturen mit Mykoplasmen ermöglichen.