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Zellkultur frei von Mykoplasmen

Reagenzien für mykoplasmenfreies Arbeiten

Die Verunreinigung von Zellkulturen mit Mykoplasmen ist bislang eines der Hauptprobleme in der zellbiologischen Forschung. Wegen ihrer parasitären Eigenschaften und der guten Anpassung an die Wirtszellen finden sich Mykoplasmen häufig als Kontamination in Zellkulturen.[1]

Aufgrund des Fehlens einer Zellwand, was den Mykoplasmen eine sehr flexible Form verleiht, und ihrer geringen Größe (typischerweise 0,2 – 0,3 μm) sind sie weder im konventionellen Mikroskop zu entdecken noch über eine Sterilfiltration aus den Medien zu entfernen.

Mykoplasmen bleiben auch wegen des Fehlens von makroskopischen Effekten oftmals sehr lange Zeit unentdeckt. Gerade beim routinemäßigen Arbeiten mit Antibiotika fällt ein Befall der Kultur mit Mykoplasmen, insbesondere durch das Laborpersonal lange Zeit nicht auf, da die Kontamination mit anderen Bakterien durch die zugesetzten Antibiotika selektiv verhindert wird, während die gleichzeitig mit eingeschleppten Mykoplasmen sich ungehindert vermehren können.

Es erscheint vor diesem Hintergrund kaum verwunderlich, dass verschiedene Studien eine Kontamination von bis 40% der Zellkulturen mit Mykoplasmen ergeben haben. Als mögliche Ursachen für diese hohe Zahl an Kontaminationen gelten die Einschleppung durch Seren oder Trypsin, das Laborpersonal, fremde Zellkulturen oder letztendlich die Tiere, aus denen die Zellkultur gewonnen wurde.[3]

 

Literatur:
1. H.G. Drexler, C. Uphoff; Cytotechnology 39(2), 75 – 90 (2002) [PubMed ID: 19003295]
2. Photo: M. Rohde, GBF, Braunschweig; C. Uphoff, DSMZ, Braunschweig
3. T. Lindl, J. Bauer: „Zell- und Gewebekultur“; Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1987); R.J. Hay, M.L. Macy, T.R. Chen; Nature 339, 487 (1989) [PubMed ID: 2725683]

 

Da das Vorhandensein einer Kontamination die Ergebnisse, die aus Zellkulturen gewonnen werden, verfälschen bzw. im schlimmsten Fall das Wachstum der Zellen so stark beeinträchtigen kann, dass es zum Totalverlust der Kultur kommt, müssen Zellkulturen routinemäßig auf Mykoplasmenbefall untersucht werden. Speziell im Falle der Transfektion von Zellen muss eine Kontamination mit Mykoplasmen auf jeden Fall ausgeschlossen werden, da durch ihren negativen Einfluss auf das Wachstum und die Stoffwechselaktivität der Zellen die Transfektionseffizienzen drastisch absinken.

 

Kleine Ursache – große Wirkung: Mykoplasmen

Bei Mykoplasmen handelt es sich um eine von mehreren Arten parasitisch oder kommensalisch mit Menschen, Tieren und Pflanzen lebenden Bakterien aus der Klasse der Mollicutes. Die über 100 bis heute bekannten Arten der Gattung Mykoplasma beschränken sich per Definition auf Wirbeltiere als Wirte, wo sie als Erreger für zahlreiche Krankheiten (z.B. Lungenentzündung durch Mykoplasma pneumoniae) bekannt sind.

Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Mykoplasmen-Kolonie auf einer Zelloberfläche

Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Mykoplasmen-Kolonie auf einer Zelloberfläche [2]

Mykoplasmen zeichnen sich besonders durch ihre geringe Größe und das Fehlen einer Zellwand aus. Deswegen sind auch Antibiotika, die die Zellwände angreifen, bei Mykoplasmen wirkungslos. Das Genom ist mit 0,58 – 1,38 Megabasenpaaren bei einem niedrigem GC-Gehalt (18 – 40 mol%) das kleinste aller zur Autoreplikation befähigten Prokaryonten.

Mykoplasmen sind als Aerobier bis fakultative Anaerobier ideal an ihre Wirte angepasst und finden gerade deshalb unter Zellkulturbedingungen (37°C) optimale Wachstumsbedingungen vor.

 

Mykoplasmen ...

...beeinträchtigen das Zellwachstum
...verringern die Stoffwechselaktivität der Wirtszellen
...modulieren die zelluläre Cytokinproduktion
...induzieren chromosomale Aberrationen in vitro
...passieren Standard-Sterilfilter
...sind unempfindlich gegenüber üblicherweise in der Zellkultur eingesetzten Antibiotika wie Penicillin oder Streptomycin
...sind resistent gegenüber hohen Temperaturen und Austrocknung
...beeinträchtigen die Transfizierbarkeit von Zellen

Kontamination mit Mykoplasmen:

In nahezu allen bekannten Zelltypen können sich Mykoplasmen parasitär vermehren, was eine ubiquitäre Verbreitung zur Folge hat. Hauptkontaminationsquellen sind Laborpersonal, aber auch Trypsin und FBS, beides über tierische Quellen erzeugte Zellkulturadditive. Die meisten Anbieter dieser Medien können lediglich für Mykoplasmenfreiheit unterhalb der Detektionsgrenze garantieren, was jedoch ein unzureichendes Kriterium darstellt. Schon eine einzige Zelle sorgt für die Durchseuchung eines kompletten Zellkulturansatzes. Die Abbildung zeigt den Effekt einer Mykoplasmenkontamination auf das Wachstum von HeLa Zellen.

 

Effekt einer Mykoplasmenkontamination auf das Wachstum von HeLa Zellen

Einflussnahme der Mykoplasmen auf die Transfektionseffizienz:

Das Besondere an der Mykoplasmen-Kontamination ist, dass jene optisch nicht sichtbar ist und nicht zum Zelltod führt, weshalb sie über einen sehr langen Zeitraum unentdeckt bleiben kann. Trotzdem beeinträchtigen diese Bakterien in ganz erheblichem Maße den Transfektionserfolg:

    • • Aufgrund des hohen Bedarfs an Arginin wird das Zellwachstum erheblich eingeschränkt
    • • Mykoplasmen modulieren die Zytokin-Produktion der Zelle
    • • Mykoplasmen verursachen chromosomale Abberationen
    • • Mykoplasmen halten sich in der Zellmembran auf, wodurch Zellmembranvorgänge, wie Endozytose, moduliert werden können.

Alle hier beschriebenen Einflüsse der Kontamination auf die physiologischen Prozesse der Zelle sind auch wesentlich am Transfektionsprozess beteiligt. Eine erhebliche Beeinträchtigung der Transfektion ist somit nicht verwunderlich und zeigt sich in der Graphik anhand von HeLa und HepG2 Zellen. Mit den kontaminierten Zellen konnten jeweils nur 17 und 5.6 % der normalen Transfektionseffizienz erreicht werden.

Einflussnahme von Mykoplasmen auf die Transfektionseffizienz | Biontex

Es wurden Hela- und HepG2-Zellen mit pCMVßgal auf 48 Well-Platten transfiziert. Die spezifischen Absorptionswerte wurden mittels ONPG- und BCA-Assay ermittelt.

 

Häufig werden Mykoplasmen mit Hilfe eines Fluoreszenz-Farbstoffes (DAPI) mikroskopisch nachgewiesen. DNA wird durch DAPI anfärbt, wodurch der Zellkern sichtbar wird und im Falle von Kontamination die sehr viel kleineren Mykoplasmen. Allerdings ist viel Erfahrung zur Beurteilung des Erscheinungsbildes nötig und somit ist dieser Nachweis nicht sicher.

 

Zur Detektion von Mykoplasmen bieten wir daher MycoSPY® an, eine Reihe PCR-basierter Kits, die Mykoplasmen zuverlässig nachweisen. Diese Produkte können sowohl bei etablierten Zelllinien als auch bei Primärzellen eingesetzt werden.

 

Gängige Untersuchungsmethoden zur Mykoplasmendetektion

DAPI-Färbung

Eine sehr häufig eingesetzte Methode zur Erkennung von Mykoplasmen ist die Färbung mit DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol). DAPI interkaliert in die kleine Furche der DNA und zeigt dort unter UV-Anregung eine blaue Fluoreszenz mit einem Maximum bei 460 nm. In unbefallenen Zellkulturen sind lediglich die Zellkerne angefärbt, während in kontaminierten Kulturen die DNA der an der Zelloberfläche befindlichen Mykoplasmen ebenso gefärbt wird. Aufgrund der geringen Größe können einzelne Mykoplasmenzellen nicht aufgelöst werden, erst bei einer sehr großen Zahl äußert sich ihr Vorhandensein durch einen oft nicht eindeutig identifizierbaren Schleier um die Zellkerne.

PCR

Eine demgegenüber weitaus empfindlichere und verlässlichere Nachweismethode stellt die Polymerasekettenreaktion (PCR) dar, mit deren Hilfe eine Kontamination durch Mykoplasmen bereits in einem sehr frühen Stadium und bei sehr niedriger Konzentration detektiert werden kann. Dieses Verfahren lässt sich im Zelllabor routinemäßig einsetzen.

Sonstige

Oft werden ELISA-Tests für den routinemäßigen Nachweis von Mykoplasmen eingesetzt. Diese Methode ist dem DAPI-Test jedoch bezüglich ihrer Sensitivität und Spezifität keineswegs überlegen. Weiterhin wäre die Elektronenmikroskopie zu nennen, die jedoch einen sehr viel höheren apparativen und zeitlichen Aufwand erfordert.

 

Vergleich MycoSPY® und DAPI-Färbung zur Erkennung von Mykoplasmen

Mit DAPI gefärbte Cos7-Zellen ohne
Kontamination durch Mykoplasmen. Nur die Zellkerne sind gefärbt.

Der Befall dieser HepG2-Zellen mit
Mykoplasmen ist in der DAPI-Färbung nicht zu erkennen.

Diese mit DAPI gefärbten H441-Luc-Zellen
zeigen erst bei einer extrem starken
Kontamination durch Mycoplasmen eine
schwach erkennbare
Färbung an der Zellperipherie.

Ein eindeutiger Nachweis wird bei
allen drei Zelllinien erst mit
MycoSPY® erbracht. Die Bande
bei 500 bp zeigt zweifelsfrei die
Mykoplasmenkontamination an.
Die interne Kontrolle bei 700 bp ist bei
der massiven Kontamination (Spur 3)
nicht mehr zu detektieren.

DAPI Färbung von Cos7 und HepG2 Zellen
DAPI Färbung von H441-Luc Zellen und Mykoplasmendetektion mittels MycoSPY

 

Methode DAPI-Test ELISA MycoSPY® Elektronenmikroskop
Aufwand + + + −−
Kosten ++ 0 + −−
Empfindlichkeit −− ++ +
Gesamt + 0 ++++ −−−