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FAQ - Transfektion

Frequently Asked Questions

► Wovon hängt es ab, ob sich eine Zelle leicht, schwer oder gar nicht mit DNA transfizieren lässt?

Grundsätzlich spielt die Endozytose- und Proliferationsfähigkeit einer Zellart eine entscheidende Rolle, denn zunächst gelangen die Lipoplexe über die Endozytose in das Zytosol, um dort aus den Endosomen freigelassen zu werden. Lipoplexe bzw. dekomplexierte DNA kann nur in den Zellkern gelangen (die sogenannte „Nuclear Barrier“ überwinden), wenn sich während der Zellteilung die Zellkernmembran kurzzeitig auflöst. Wenn einer der beiden Prozesse nur wenig ausgeprägt verläuft, kann die Transfektionseffizienz entsprechend gering ausfallen. Somit ist es nicht verwunderlich, dass wenig oder gar nicht proliferierende Zellen, wie z.B. Primär- oder Nervenzellen, oder auch solche mit geringer Endozytoseaktivität, wie z.B. Jurkat-Zellen, als schwierig zu transfizieren gelten. Ein weiterer wichtiger Faktor stellt das für jede Zellart unterschiedlich ausgeprägte angeborene Immunsystem dar. Zellen sind allgemein in der Lage fremde Nukleinsäuren zu detektieren und einen Abwehrstatus einzunehmen. Zellen mit einem wenig ausgeprägten angeborenen Immunsystem (z.B. HEK293 Zellen) lassen sich dementsprechend leicht transfizieren, während Zellen mit einem ausgeprägten angeborenen Immunsysten (z.B. Jurkat Zellen) schwer zu transfizieren sind.
Erschwerend kommt hinzu, dass die oben genannten Phänomäne nicht nur von Zellart zu Zellart, sondern auch bei Kulturen einer Zellart verschieden ausfallen können. Bei gleichnamigen Zellarten können dementsprechend in unterschiedlichen Universitäten oder gar Arbeitskreisen innerhalb einer Einrichtung Unterschiede auftreten. Manchmal sind diese Unterscheide auch schon während einer langzeitigen Passagierung einer Zelllinie beobachtbar. Diese Komplexität erschwert die Übertragung von Protokollparametern unter verschiedenen Anwendern, auch wenn es sich um einen vermeintlich gleichen Zelltypus handelt.

► Ich habe bisher ein anderes Transfektionsreagenz benutzt. Kann ich z.B Metafectene mit dem optimierten Protokoll des alten Reagenzes nutzen?

Nein, denn jedes Transfektionsreagenz ist durch seine sehr spezifischen Eigenschaften charakterisiert. Dazu gehören beispielsweise:

Spezifische Zusammensetzungen und Anteile an Kolipiden
Spezifische Nettoladung pro Molekül
Aggregatstabilität, Lipoplexstabilität (Schmelzpunkt)

Diese differierenden Eigenschaften haben unmittelbaren und spezifischen Einfluss auf deren Zusammenwirken mit der Nukleinsäure und der jeweiligen Zellart, eine Übertragbarkeit von Protokollparametern von einem zum anderen Reagenz ist daher nicht möglich.

► Kann die Transfizierbarkeit einer bestimmten Zellart prognostiziert werden?

Nein, das ist bisher nicht möglich. Das Zusammenspiel der ganz spezifischen Eigenschaften einer jeden Zellart und eines jeden Transfektionsreagenzes ist derartig komplex, dass Prognosen über erzielbare Transfektionseffizienzen selten gelingen. Es gibt allerdings Erfahrungswerte, dass z.B. ruhende Zellen, Suspensionzellen und Primärzellen in der Regel eher schwer zu transfizieren sind. Es gibt allerdings auch Ausnahmen.

► Welche Zellkulturbedingungen sind ideal für optimale Transfektionsergebnisse mit DNA?

Grundsätzlich gilt für die Transfektion von DNA mit synthetischen Carriersystemen, dass diese nur über die Zellteilung die sogenannte Nuklear-Barriere überwinden kann. Daraus ergeben sich notgedrungen folgende zu beachtende Hinweise:
Die Zahl der Zellkulturpassagen sollte kleiner als 30 sein. Es findet mit jeder Passage gewissermaßen eine genetische Differenzierung statt. Das heißt, solche Zellen, die den Passagierstress am besten ertragen können, werden übermäßig wachsen. Daraus ergeben sich im Laufe der Zeit genetische Distanzen zu den Urspungszellen.
Die Zellen sollen zum Zeitpunkt der Transfektion schnellst möglich wachsen. Die Zellen sollten immer im hoch proliferierenden Zustand, der sogenannten log- oder Exponentialphase, gehalten werden. Optimal kann dies erreicht werden, indem man ein für schnelles Wachstum geeignetes Kulturmedium auswählt und eine Wachstumskurve der Anwenderzellart im entsprechenden Format erstellt und damit die optimale auszusähende Zellmenge und Wachstumsdauer einstellt. Solche Zellen, die zeitweise im konfluenten Zustand gehalten werden, zeigen aufgrund der Wachstumsinhibierung erst nach mehreren Passagen wieder vollständiges Wachstumsvermögen.

Ideale Wachstumskurve von Zellen | Biontex

Optische Konfluenz ist nicht gleich reelle Konfluenz. Aus einer Wachstumskurve lässt sich erschließen, inwieweit die optisch ermittelte Konfluenz (= komplette Wachstumsfläche ist bedeckt) mit der reellen Konfluenz (= Phase 5 der Wachstumskurve) übereinstimmt. Meistens liegen diese beiden „Konfluenzwerte“ deutlich auseinander. Am Beispiel COS7 Zellen (siehe Graphik) wird der häufigste Fall deutlich, dass bei optisch bestimmter Konfluenz erst die beginnende Wachstumsphase 3 erreicht wird. Daher sollten die Zellen am Tage vor der Transfektion, sofern jene an adhärenten Zellen durchgeführt werden soll, eine optisch ermittelte Konfluenz von ca. 90 % aufweisen.

Reale Wachstumskurve von COS-7 Zellen | Biontex

► Wie finde ich die optimalen Parameter für die Lipoplexbildung?

Die Morphologie der Lipoplexe hängt zum einen entscheidend von der Art des kationischen Lipids und der Lipidkomposition des jeweiligen Transfektionsreagenzes, zum anderen vom Mengenverhältnis des genetischen Materials zum Transfektionsreagenz ab. Jede Zellart zeigt sich unterschiedlich gut transfizierbar in Abhängigkeit von einer resultierenden Lipoplexmorphologie. Es müssen demnach folgende Parameter über einen Optimierungsprozess zur optimalen Transfektion ermittelt werden:
Als erstes muss das optimale DNA/RNA-Lipid-Mengenverhältnis herausgefunden werden. Generell wird angenommen, dass Lipoplexe eine positive Nettoladung benötigen, um elektrostatische Wechselwirkungen mit der negativ geladenen Zellmembranoberfläche für eine erfolgreiche endozytotische Aufnahme überhaupt eingehen zu können. In den meisten Fällen wird dieses Verhältnis im Bereich 1-7µl Lipid zu 1µg DNA/RNA liegen.
Der zweite wichtige Faktor ist die Lipoplexmenge pro Zelle, denn bei zu hoher Menge überkompensiert die auftretende Toxizität den Transfektionserfolg. Somit sollte die Lipoplexmenge mit dem bekannten optimalen DNA/RNA-Lipid-Verhältnis variiert werden.

► Ich beobachte toxische Effekte bei der Transfektion. Woran kann das liegen?

Kationische Lipide können die in die Zellmembran gelangen und diese destabilisieren. Dies ist vermutlich der Hauptgrund für steigende Toxizität bei zu hoher Lipidmenge innerhalb der Lipoplexe. Daher sind der Verwendung hoher Lipidmengen im Verhältnis zur DNA/RNA-Menge Grenzen gesetzt. Aus bislang unbekannten Gründen haben Lipoplexe wesentlich toxischere Wirkung auf Zellen als die Transfektionsreagenzien selbst. Es ist jedoch anzunehmen, dass das angeborene Immunsystem nach der Detektion von fremden Nukleinsäuren Apoptose auslöst, die von Toxizität nur schwer zu Unterscheiden ist. Daraus ergibt sich die zweite Einschränkung, dass sich zu hohe Lipoplexmengen kontraproduktiv auf den Transfektionserfolg auswirken.
Eine weitere Ursache für Toxizität kann die gewünschte Zellmanipulation selbst sein. Das zu exprimierende oder das über siRNA zu inhibierende Gen oder Genprodukt selbst, kann erhebliche Auswirkungen auf die Zellphysiologie haben. In diesem Fall kann die optimale Transfektion zu hoher Zellmortalität führen, die nur durch Herabregulierung der Transfektionseffizienz umgangen werden kann.

► Welchen Einfluss hat das Kulturmedium und das im Kulturmedium verwendete Serum auf den Transfektionserfolg?

Das in der Zellkultur verwendete Serum (z.B. FCS, FBS) ist ein hoch komplexes, undefiniertes Gemisch aus wasserlöslichen Blutbestandteilen, wie z.B. Wachstumsfaktoren, Nahrungsstoffe, und hat grundsätzlich erhebliche Einflüsse auf den Transfektionserfolg.

Serum hat hohe lipoplex-inhibierende Eigenschaften: Dies bedeutet, dass während der Lipoplexbildung (nach dem Zusammenführen von Transfektionsreagenz und genetischem Material) kein Serum anwesend sein darf.
Serum hat bei modernen Reagenzien keinen Einfluss auf die schon ausgebildeten Lipoplexe. Dies bedeutet, dass bei diesen Transfektionsreagenzien die ausgebildeten Lipoplexe ohne Nachteile für das Transfektionsergebnis auf die Zellen mit serumenthaltigem Zellkulturmedien gegeben werden können. Tatsächlich erhält man mit diesen Reagenzien regelmässig vergleichsweise bessere Transfektionseffizienzen in Anwesenheit von Serum.
Serum fördert das Wachstumsverhalten der Zellen: Aufgrund seiner Bestandteile, wie z.B. Wachstumshormone, wird das Wachstum und damit die Zellteilungsrate der zu transfizierenden Zellen wesentlich erhöht, was wiederum die Transfektionseffizienz stark verbessert. Das Wachstumsverhalten sollte auch bei der Auswahl eines geeigneten Kulturmediums berücksichtigt werden. Stehen mehrere Möglichkeiten zur Auswahl, sollte das Medium ausgewählt werden in dem die Proliferationsrate der Zellen am höchsten ist.
Seren haben sehr limitierten Haltbarkeitszeitraum (maximal 1 Monat): Man sollte sehr darauf achten, dass das Haltbarkeitsdatum des Serums bei deren Verwendung nicht überschritten ist, da dies zur erheblichen Reduktion von für die Zellen bedeutenden Inhaltsstoffen führt. Die Zellen zeigen dann ein komplett verändertes und reduziertes Wachstumsverhalten (siehe Graphik), wodurch optimale Transfektionsergebnisse nicht mehr erreichbar sind.
Seren besitzen unbekannte Zusammensetzungen und können von Charge zu Charge variieren: Diese Variabilität der Seruminhaltsstoffe kann zu sehr unterschiedlichen Transfektionsergebnissen führen, auch wenn man in der Lage ist, alle sonstig bekannten Einflussparameter konstant zu halten.

► Haben Mykoplasmen einen Einfluss auf den Transfektionserfolg?

Ja, denn jegliche Kontamination der Zellkultur, sei es mit Pilzen, Viren oder Bakterien, hat erheblichen Einfluss auf die Transfektionsergebnisse, denn meist erfolgt hierbei ein letztendliches Absterben der gesamten Zellkultur. Das Besondere an der Mykoplasmen-Kontamination ist, dass sie optisch nicht sichtbar ist und nicht zum Zelltod führt, weshalb sie über einen sehr langen Zeitraum unentdeckt bleiben kann. Trotzdem beeinträchtigen diese Bakterien in ganz erheblichem Maße den Transfektionserfolg:
Aufgrund des hohen Bedarfs an Arginin wird das Zellwachstum erheblich eingeschränkt (siehe Graphik)
Mykoplasmen werden durch das angeborene Immunsystem erkannt und modulieren die Zytokin-Produktion der Zelle
Mykoplasmen verursachen chromosomale Abberationen
Mykoplasmen halten sich in der Zellmembran auf, wodurch Zellmembranvorgänge, wie Endozytose, moduliert werden können.
Vergleich des Zellwachstums von HeLa-Zellen mit und ohne Mykoplasmenbefall:

Vergleich des Zellwachstums von HeLa-Zellen mit und ohne Mykoplasmenbefall | Biontex

Auswirkungen des Mykoplasmenbefalls auf die Transfektionseffizienz:

Auswirkungen des Mykoplasmenbefalls auf die Transfektionseffizienz | Biontex

Es wurden Hela- und HepG2-Zellen mit pCMVßgal auf 48 Well-Platten transfiziert. Die spezifischen Absorptionswerte wurden mittels ONPG- und BCA-Assay ermittelt. Die erhebliche Beeinträchtigung der Transfektion durch Mycoplasmenkontamination zeigt sich in beeindruckender Weise in folgender Graphik anhand HeLa und HepG2 Zellen. Mit den kontaminierten Zellen konnten nur 17 und 5.6 % der normalen Transfektionseffizienz erreicht werden:

In nahezu allen bekannten Zelltypen können sich Mykoplasmen parasitär vermehren, was eine ubiquitäre Verbreitung zur Folge hat. Ca. 80% aller japanischen, 65% aller argentinischen und ca. 15% aller US amerikanischen Zellkulturen sind schätzungsweise durch Mykoplasmen verseucht. Hauptkontaminationsquellen sind das Laborpersonal oder auch Trypsin und FBS, beides über tierische Quellen erzeugte Zellkulturadditive.

► Wie überprüfe ich, ob meine Zellen mit Mykoplasmen kontaminiert sind?

Eine alt gediente Detektionsmethodik für Mykoplasmen ist die DAPI-Anfärbung, jedoch können aufgrund der sehr niedrigen Detektionsempfindlichkeit nur erhebliche Kontaminationen angezeigt werden. Die PCR-Methodik ist deutlich empfindlicher und stellt daher die Detektionsmethode der Wahl dar. Biontex bietet hierfür den komplett ausgestatteten Detektionskit MycoSPY an, wodurch schon einzelne Kopien des Mykoplasmengenoms identifiziert werden können.

► Welchen Einfluss haben die Art der DNA/RNA und dessen Qualität auf den Transfektionserfolg?

Grundsätzlich gilt, dass ein höherer Reinheitsgrat des genetischen Materials auch immer zu besseren Ergebnissen in der Transfektion führt. Besonders zu beachten ist die Verunreinigung durch Lipopolysacharide, die sogenannten Endotoxine. Sie werden über den Herstellungsprozess mittels Bakterien eingeschleppt und erzeugen bei Säugerzellen in der Regel schon in geringsten Mengen eine immunologische Reaktion durch das angeborene Immunsystem und damit auch eine starke Beeinträchtigung des Transfektionsprozesses. Man sollte somit darauf achten, dass der Aufreinigungsprozess des genetischen Materials auch die Entfernung von Endotoxinen beinhaltet. Entsprechende Kits sind kommerziell erhältlich. Aufreinigungen von Plasmiden basierend auf sogenannten Miniprep Protokollen sind für Transfektionszwecke nicht zu empfehlen.
Der spezifische Aufbau des genetischen Materials hat unmittelbare Auswirkungen auf den Transfektionserfolg:
Promotoren besitzen spezifische Expressionsraten: Daraus ergibt sich zwangsweise eine charakteristische Menge bzw. Menge pro Zeiteinheit an Expressionsprodukten in der Zelle.
Spezifische Eigenschaften des zu exprimierenden Gens bzw. des resultierenden Proteins können zellabhängig erheblichen Einfluss auf die Physiologie der Zelle bis zu ihrer Mortalität ausüben.
Auch die Größe und die Tertiärstruktur des genetischen Materials beeinflusst den erreichbaren Transfektionserfolg. Generell gelten folgende Aussagen:
Die Transfizierbarkeit einer Zelle sinkt mit der Größe des genetischen Materials
Supercoiled Plasmide sind höher effizient bei transienter Transfektion, lineare DNA ist besser geeignet für stabile Transfektionen.

► Ich will in ein anderes Zellkulturformat wechseln, worauf muss ich achten?

Lipoplexe adhäsieren an den freien Plastikoberflächen der Zellkulturgefäße und stehen dem Transfektionsprozess nicht mehr zur Verfügung. Daher können für ein Gefäßformat ermittelte optimierte Mengen an Lipoplexen nicht einfach proportional auf andere Formate übertragen werden.
Umso kleiner das verwendete Gefäßformat ist, desto höher muss die eingesetzte Lipoplexmenge/cm2 sein. Beispiel: Beim Downscale von einer 6-Well-Schale zum 96Well-Format muss für ähnlich gute Transfektionseffizienz ca. die 3fache Lipolexmenge/mm2 verwendet werden.

► Gibt es bei Biontex für eine bestimmte Zelllinie und ein bestimmtes Transfektionsreagenz ein spezifisches Protokoll?

Nein, denn die Vielzahl der in den FAQs angegebenen Parameter als Einflussgrößen für eine erfolgreiche Transfektion stellt klar, dass die Bereitstellung spezifischer Protokolle für eine generelle Anwendung schwierig ist. Die auf unserer Webseite aufgelisteten, veröffentlichten Anwendungsberichte oder Veröffentlichungen können daher nur Anhaltspunkte für eine mögliche erfolgreiche Transfektion liefern. Letztendlich muss aber in der eigenen Laborumgebung optimiert werden.

► Was bewirkt der in den manchen Manuals beschriebene Freeze-Thaw-Zyklus?

Liposomen neigen bei Langzeitlagerung bei Raumtemperatur oder 4°C zur Koagulation. Das bedeutet, dass sich die Größenverteilung der Liposomen zu größeren Liposomen hin verschiebt, was negative Auswirkungen auf die Transfektionseffizienz haben kann. Das Einfrieren und Auftauen von Lipiden (Freeze-Thaw) wird häufig auch zur Herstellung von Liposomen verwendet und kann daher für manche Reagentien auch dazu verwendet werden, die ideale Liposomengrößenverteilung wiederherzustellen. Dazu wird das Transfektionsreagenz im Gefrierschrank eingefroren und anschließend bei Raumtemperatur wieder aufgetaut. Anschließend wird sanft gevortext und das Reagenz wieder bei 4°C gelagert. Es wird empfohlen einen solchen Freeze-Thaw-Zyklus für die Metafectene Serie und das K2 Transfection Reagent vor der ersten Anwendung und anschließend alle 2 Monate durchzuführen.